自然殺傷(NK)細(xì)胞是一類獨(dú)特的天然淋巴樣細(xì)胞，具有識(shí)別和清除病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的固有能力。NK細(xì)胞具有多種細(xì)胞毒機(jī)制和通過細(xì)胞因子的產(chǎn)生調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的能力，在抗癌免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。近年來，隨著嵌合抗原受體(CAR)工程的過繼T細(xì)胞療法的成功，以及將細(xì)胞轉(zhuǎn)化為強(qiáng)大的抗腫瘤武器的技術(shù)進(jìn)步，人們對NK細(xì)胞作為免疫治療候選細(xì)胞的興趣呈指數(shù)級(jí)增長。在臨床上，第一代NK細(xì)胞療法取得了令人振奮的結(jié)果，顯示出了強(qiáng)大的療效和顯著的安全性，從而推動(dòng)了繼續(xù)創(chuàng)新的巨大熱情。本文就增強(qiáng)NK細(xì)胞毒性和持久性的各種策略做一個(gè)簡單介紹，以指導(dǎo)如何設(shè)計(jì)下一代NK細(xì)胞產(chǎn)品。

01
CAR/TCR工程化NK細(xì)胞

嵌合抗原受體(CARs)是一種人工合成的融合蛋白，由胞外抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號(hào)部分組成，可觸發(fā)細(xì)胞激活。CAR工程T細(xì)胞療法是第一個(gè)出現(xiàn)的，并開發(fā)了用于免疫腫瘤學(xué)應(yīng)用的各種產(chǎn)品。自那以后，該領(lǐng)域迅速擴(kuò)大，NK細(xì)胞也被整合到基因工程管道中。研究表明， CAR工程化NK細(xì)胞可以有效和特異性地靶向腫瘤，同時(shí)保持理想的安全性 (圖1) 。

圖1. CAR NK細(xì)胞示意圖

基于CAR的細(xì)胞治療的一個(gè)關(guān)鍵障礙是抗原逃逸，這是腫瘤通過抗原丟失或下調(diào)來逃避免疫反應(yīng)的過程。已經(jīng)采取了各種戰(zhàn)略來解決這一問題。靶向多種抗原是一種可行的方法，既可以提高腫瘤檢測的嚴(yán)格性，又可以擴(kuò)大治療效益(圖2)。這通常是通過表達(dá)兩個(gè)單獨(dú)的CAR(每個(gè)CAR針對腫瘤上的不同抗原并連接到兩個(gè)單獨(dú)的信號(hào)內(nèi)域)的雙順反子構(gòu)建體來實(shí)現(xiàn)的，或者通過表達(dá)包含雙特定識(shí)別結(jié)構(gòu)域的單個(gè)CAR來實(shí)現(xiàn)的，每個(gè)CAR串聯(lián)靶向不同的抗原并連接到單個(gè)信號(hào)內(nèi)域。

圖2.多抗原靶向CAR NK策略

還探索了改進(jìn)CAR介導(dǎo)的激活控制的策略，特別是將靶上、腫瘤外效應(yīng)所產(chǎn)生的毒性降至最低。已經(jīng)通過使用logic-gated CAR策略來促進(jìn)選擇性靶向，被證明可以解決其中的一些問題。在這項(xiàng)工作中，研究小組通過二價(jià)CAR靶向AML細(xì)胞上的FLT3/CD33，并使用抑制性CAR將抗原結(jié)合到健康的造血干細(xì)胞(HSCs)上，并誘導(dǎo)出‘NOT signal’以防止細(xì)胞殺傷（圖3）。

圖3. logic-gated CAR策略

基于CAR的方法的另一個(gè)關(guān)鍵限制是，在大多數(shù)情況下，檢測能力僅限于表面蛋白質(zhì)。細(xì)胞內(nèi)抗原以多肽-人類白細(xì)胞抗原復(fù)合體的形式存在，通過TCR可以檢測到。改造NK細(xì)胞表達(dá)TCR可以檢測到這樣的多肽(圖4)。TCR引導(dǎo)的NK-92細(xì)胞最近被證明介導(dǎo)了成功的抗腫瘤反應(yīng)。雖然需要更多的研究來驗(yàn)證這種方法的臨床適用性，但一個(gè)潛在的優(yōu)勢是，因?yàn)镹K細(xì)胞不具有內(nèi)源性TCR，因而不會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)配的問題。然而，缺點(diǎn)是NK細(xì)胞沒有配備T細(xì)胞中的完整信號(hào)機(jī)制，從而潛在地?fù)p害了通過合成TCR有效激活的能力。

圖4. TCR NK細(xì)胞示意圖

02
NK細(xì)胞銜接器

NK細(xì)胞也可以通過銜接器被引導(dǎo)到腫瘤部位，通過觸發(fā)NK細(xì)胞上的激活受體，同時(shí)將靶抗原結(jié)合到腫瘤細(xì)胞上，從而引發(fā)強(qiáng)大的NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)(圖5)。其他NK細(xì)胞銜接器策略包括三特異性和四特異性抗體設(shè)計(jì)，旨在通過靶向腫瘤上的多個(gè)抗原或通過交叉連接細(xì)胞因子部分來支持NK增殖和存活來增強(qiáng)抗腫瘤效果。NK 細(xì)胞銜接器的使用繞過了工程化，不需要載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，因此代表了一種更簡單、成本更低的制造工藝，但可以提供CAR-like活性。

圖5. NK 細(xì)胞銜接器示意圖

各種臨床前研究表明，當(dāng)使用NK 細(xì)胞銜接器來靶向血液瘤和實(shí)體腫瘤時(shí)，展現(xiàn)了強(qiáng)大的抗腫瘤功效。例如，最近的研究表明，當(dāng)通過使用靶向AML上的CLEC12A靶向腫瘤以及人源化的抗CD16單域抗體和IL-15激活NK細(xì)胞的三特異性NK 細(xì)胞銜接器，NK細(xì)胞對原發(fā)AML患者來源的AML體內(nèi)腫瘤模型具有強(qiáng)大抗腫瘤效應(yīng)（圖6）。

圖6. CLEC12ATriKE體內(nèi)抗腫瘤效果

一些臨床試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的開展，需要評(píng)估這些NK細(xì)胞銜接器的抗腫瘤效果的持久性，并確定是否需要多種治療才能獲得持續(xù)的治療效果。

03
細(xì)胞因子武裝

雖然CAR和TCR工程技術(shù)尋求通過基因重定向其特異性來增強(qiáng)NK細(xì)胞的功能，但也有一些舉措旨在有效地在體外和體內(nèi)激活NK細(xì)胞，以維持最佳的抗腫瘤功能和持久性。眾所周知，新分離的NK細(xì)胞與已被激活的NK細(xì)胞相比，其殺細(xì)胞能力較低。解決這一限制的一種方法是細(xì)胞因子介導(dǎo)的激活。用IL-2、IL-15和IL-21組合的細(xì)胞因子體外擴(kuò)增NK細(xì)胞增強(qiáng)了細(xì)胞毒功能、高增殖率，同時(shí)保持細(xì)胞處于健康、未耗竭的狀態(tài)。

現(xiàn)在已經(jīng)很清楚，當(dāng)在IL-12/15/18存在的情況下培養(yǎng)時(shí)，PB-NK細(xì)胞可以轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N被稱為細(xì)胞因子誘導(dǎo)的記憶樣NK細(xì)胞的表型。在移植前和移植后的環(huán)境中，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的記憶樣NK細(xì)胞在R/R復(fù)發(fā)性髓系腫瘤患者中都顯示出臨床療效。設(shè)計(jì)記憶樣NK細(xì)胞來表達(dá)CAR可以增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)，從而增強(qiáng)對抗NK耐藥腫瘤的效力。

盡管這些數(shù)據(jù)有力地表明了細(xì)胞因子激發(fā)的優(yōu)勢，但持續(xù)的體外刺激會(huì)使NK細(xì)胞“細(xì)胞因子成癮”，并導(dǎo)致在缺乏體內(nèi)細(xì)胞因子支持的情況下輸注這些細(xì)胞時(shí)其持久性降低。為了避免這個(gè)問題，同時(shí)仍然利用細(xì)胞因子激活的好處，通過基因工程，NK細(xì)胞被修飾以產(chǎn)生支持細(xì)胞潛能、增殖和持久性的細(xì)胞因子(圖7)。這種自分泌細(xì)胞因子極大的引起了研究人員的興趣，CAR工程化的NK細(xì)胞為了提高其持久性也采用了攜帶補(bǔ)充細(xì)胞因子信號(hào)的基因工程化策略。由工程N(yùn)K細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子還可以介導(dǎo)旁觀者效應(yīng)，從而激活存在于腫瘤微環(huán)境中的其他免疫效應(yīng)細(xì)胞，如T細(xì)胞或髓系細(xì)胞，從而潛在地進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)。

圖7. NK細(xì)胞細(xì)胞因子基因工程修飾

04
克服免疫抑制

TME由復(fù)雜和嚴(yán)酷的代謝環(huán)境組成，其特征是免疫抑制代謝物、葡萄糖和氨基酸缺乏、低氧和酸性的異質(zhì)混合。這些因素協(xié)同作用阻止了有效的抗腫瘤免疫。特別是在實(shí)體腫瘤中，缺氧是免疫細(xì)胞功能障礙的常見驅(qū)動(dòng)因素。已有研究表明，缺氧性TME中NK細(xì)胞功能受損，部分原因是MDSCs、Treg和M2巨噬細(xì)胞在TME中的含量增加，以及缺氧對NK細(xì)胞功能的直接影響。據(jù)報(bào)道，抑制NK細(xì)胞中缺氧反應(yīng)的HIF1a信號(hào)可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的效力，并釋放NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤功能。

腫瘤往往表現(xiàn)出異常的代謝行為，導(dǎo)致乳酸水平升高、重要營養(yǎng)物質(zhì)枯竭以及有毒分解代謝物、腺苷和活性氧類濃度增加。為了克服代謝免疫抑制的有害影響，目前的策略主要集中在兩個(gè)領(lǐng)域：改變腫瘤的代謝構(gòu)成或修改免疫細(xì)胞中的基因表達(dá)程序，以保護(hù)它們免受TME中抑制代謝物的影響。當(dāng)然我們試圖調(diào)節(jié)TME中的免疫代謝時(shí)，實(shí)現(xiàn)生理平衡是很重要的，因?yàn)橐恍┐x物是正常代謝的重要組成部分。目前許多策略仍在開發(fā)中，通過TME調(diào)節(jié)和NK細(xì)胞工程相結(jié)合的方法可能會(huì)進(jìn)一步減少免疫抑制。

05
免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)

腫瘤已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的機(jī)制來逃避免疫監(jiān)視，包括參與免疫檢查點(diǎn)，這可能會(huì)以與T細(xì)胞類似的方式抑制NK細(xì)胞。

抑制性KIR是NK細(xì)胞功能的強(qiáng)有力的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，當(dāng)與HLA class I類配體結(jié)合時(shí)，可以覆蓋任何伴隨的激活信號(hào)。由于其在抑制NK細(xì)胞功能中的重要作用，抑制性KIR引起了研究者與制藥公司的極大興趣。Lirilumab是一種panKIR2D抗體，通過阻斷這些抑制性KIRs，使NK細(xì)胞激活。然而，在兩個(gè)早期臨床試驗(yàn)中，Lirilumab未能引起有臨床意義的應(yīng)答。這些結(jié)果的一個(gè)潛在原因可能源于抑制性KIR在NK細(xì)胞教育和licensing的重要作用。在這一假設(shè)下，Lirilumab持續(xù)阻斷KIRs可能會(huì)對NK細(xì)胞功能產(chǎn)生負(fù)面影響。

與KIR分子類似， NKG2A是另一種重要的負(fù)性NK細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，當(dāng)與其同源配體HLAE結(jié)合時(shí)，可抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。Monalizumab破壞了這種相互作用，當(dāng)與西妥昔單抗聯(lián)合使用時(shí)，在以前治療過的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者中產(chǎn)生了的31%的客觀應(yīng)答率。Monalizumab目前正在接受針對其他實(shí)體腫瘤的測試，包括結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞肺癌等。

這些方法的共同之處是依賴單抗來調(diào)節(jié)患者的免疫細(xì)胞，然而由于它們在體內(nèi)的半衰期有限，這一策略需要多次輸注。隨著基因編輯能力的進(jìn)步，NK細(xì)胞可以穩(wěn)定地被修飾，以調(diào)節(jié)增強(qiáng)NK細(xì)胞效應(yīng)器功能。一個(gè)例子是抑制受體NKG2A的被遺傳破壞，這導(dǎo)致了接種了HLAE+腫瘤的異種移植小鼠模型中的腫瘤控制良好。

06
加強(qiáng)NK細(xì)胞對腫瘤的轉(zhuǎn)運(yùn)

NK細(xì)胞運(yùn)輸和穿透腫瘤床的能力是有效抗腫瘤免疫的關(guān)鍵先決條件。與其他免疫細(xì)胞類似，NK細(xì)胞通過TME分泌的趨化因子受體及其同源配體的動(dòng)態(tài)相互作用而被引導(dǎo)至腫瘤部位。近年來，越來越多的工作研究了如何利用這些相互作用的調(diào)節(jié)來增強(qiáng)對腫瘤的有效歸巢。

早期的研究集中在擴(kuò)增誘導(dǎo)的趨化因子受體以及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法，但由于內(nèi)化和降解導(dǎo)致趨化因子表達(dá)的迅速喪失。這使得研究者通過采用基因工程策略來穩(wěn)定地為NK細(xì)胞配備異位趨化因子受體，如CXCR2、CXCR4等。目前的臨床前數(shù)據(jù)支持趨化因子受體調(diào)節(jié)可以促進(jìn)NK細(xì)胞在多種難以治療的腫瘤中的轉(zhuǎn)移，包括多發(fā)性骨髓瘤，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，腎細(xì)胞癌，胰腺導(dǎo)管腺癌和卵巢癌等。

小結(jié)

隨著創(chuàng)新藥物策略的加速發(fā)展和下一代技術(shù)的出現(xiàn)，各種NK細(xì)胞產(chǎn)品被設(shè)計(jì)用于癌癥治療。隨著該領(lǐng)域的進(jìn)展，闡明決定NK細(xì)胞效力和持久性的關(guān)鍵參數(shù)將是重要的，這將有利于我們優(yōu)化和設(shè)計(jì)下一代基于NK的治療藥物。

參考文獻(xiàn)

1.Natural killer cells in antitumour adoptive cell immunotherapy.

2.A trispecific killer engager molecule against CLEC12A effectively induces NK-cell mediated killing of AML cells.

3.Pluripotent stem cell-derived NK cells with high-affinity noncleavable CD16a mediate improved antitumor activity.